Генерация стука Gαi

Биология связи, том 6, Номер статьи: 112 (2023) Цитировать эту статью

3075 Доступов

13 Альтметрика

Подробности о метриках

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются ключевыми белками клеточной мембраны, которые чувствуют внеклеточные молекулы и активируют клеточные реакции. Семейство α-субъединицы i (Gαi) G-белка представляет собой наиболее распространенный партнер по связыванию GPCR и состоит из восьми субъединиц с различными сигнальными свойствами. Однако анализ паттерна сцепления оказался затруднительным из-за эндогенной экспрессии субъединиц Gαi практически во всех клеточных линиях. Здесь мы создаем клеточную линию HEK293, в которой отсутствуют все субъединицы Gαi, что позволяет измерить связывание GPCR-Gαi при временной повторной экспрессии конкретной субъединицы Gαi. Мы профилируем селективность связывания Gαi для 11 GPCR путем измерения индуцированной лигандом ингибирующей активности накопления цАМФ. Профили взаимодействия затем классифицируются на три кластера, представляющие те, которые преимущественно связаны с Gαz, те, которые связаны с Gαo, и те, которые имеют неочевидную селективность. Эти результаты показывают, что отдельные Gαi-связанные GPCRs точно настраивают передачу сигналов Gαi, оказывая предпочтение связыванию на уровне субъединицы Gαi.

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), ключевые преобразователи, которые связывают внеклеточные стимулы с нижестоящими внутриклеточными сигналами, являются наиболее распространенными мишенями для разработки лекарств1. При связывании лиганда GPCR гетеромерные белки, связывающие гуаниновые нуклеотиды (G-белки), состоящие из субъединиц α, β и γ, индуцируют активацию своих эффекторных белков. Среди трех субъединиц α-субъединица в основном определяет ключевые свойства отдельных гетеротримерных G-белков. Геном человека кодирует 16 α-субъединиц, которые сгруппированы в четыре подсемейства на основе их гомологии последовательностей и функционального сходства, а именно: Gαs, Gαi, Gαq и Gα122. Подсемейство Gαi является наиболее распространенным партнером по спариванию в семействе A GPCRs3,4. Кроме того, примерно 45% GPCR, на которые нацелены лекарства, одобренные Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), соединяются с подсемейством Gαi5, что подчеркивает значимость Gαi-связанных GPCR в качестве мишеней для лекарств.

Предыдущие исследования показали, что субъединицы Gαi имеют как перекрывающиеся, так и разные функции. Подсемейство Gαi состоит из восьми субъединиц α: Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαt1, Gαt2, Gαt3, Gαo и Gαz. Активация гетеротримера Gi индуцирует различные клеточные сигнальные процессы, такие как ингибирование аденилатциклазы и кальциевых каналов, а также активация калиевых каналов6. Несмотря на высокую гомологию последовательностей внутри подсемейства Gαi, сообщалось о нескольких специфичных для субъединиц функциях. Например, трансдуцин (Gαt1 и Gαt2) и густдуцин (Gαt3) участвуют в зрительном и вкусовом восприятии соответственно, активируя цГМФ-фосфодиэстеразу7,8. Кроме того, с помощью экспериментов по нокдауну субъединицы Gαi в клетках GH4C1 было обнаружено, что Gαo и Gαi2 опосредуют ингибирование входа кальция и накопление цАМФ, соответственно9. Субъединицы Gαi также ведут себя биохимически, отличаясь друг от друга. Однако следует отметить, что эти биохимические свойства могут быть изменены в живых клетках, как это наблюдается в Gq, который показывает более медленную диссоциацию нуклеотидов в очищенном состоянии, чем в состоянии липидной мембраны. Например, скорость спонтанной диссоциации GDP от Gαo на порядок выше, чем у Gαi1-310, а собственная ГТФазная активность Gαz в 200 раз медленнее, чем у других субъединиц Gαi11. Эти различия между членами семейства Gαi позволяют осуществлять разнообразную передачу сигналов GPCR, связанную с Gαi.

Хотя сигнальные свойства субъединиц Gαi хорошо охарактеризованы, селективность связывания Gαi-субъединиц GPCRs была исследована только для ограниченного числа рецепторов из-за экспериментальных трудностей. Индивидуальную связь GPCR-Gαi нельзя оценить просто путем экспрессии интересующей субъединицы Gαi, поскольку практически все клетки млекопитающих эндогенно экспрессируют множественные субъединицы Gαi12. Чтобы устранить эндогенное связывание GPCR-Gαi, в предыдущих исследованиях использовался коклюшный токсин (PTX), который ADP-рибозилирует остаток цистеина в C-концевом хвосте субъединицы Gαi13. Экспрессируя устойчивый к PTX мутант Gαi с заменой в остатке цистеина, обработка PTX позволяет измерить селективное связывание мутантной субъединицы Gαi14,15,16. Однако изменение остатка цистеина может повлиять на способность α-субъединиц связываться с G-белком17,18. Кроме того, PTX не ингибирует Gαz, поскольку он содержит изолейцин в сайте, нацеливающем PTX19. Недавно методы, основанные на резонансном переносе энергии флуоресценции или биолюминесценции, были использованы для оценки сцепления отдельных сконструированных субъединиц Gα20,21. Однако эти методы требуют введения люциферазы или флуоресцентного белка в субъединицу α, и такая модификация влияет на ее биохимические свойства и, как следствие, эффективность связывания22.